光譜儀和分光光度計

儀器概況

       光譜儀（spectrometer）和分光光度計（Spectrophotometer）,是將成分復雜的光分解為光譜線的科學儀器。

       當光線通過某種物質的溶液時透過的光的強度減弱，因為有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光 被組成此溶液的物質所吸收，只有一部分光可透過溶液。因此：

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光。

如果我們用蒸餡水（或組成此溶液的溶劑）作為“空白"去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失，則 出現(xiàn)：

入射光=吸收光十透過光。

        不同的光源都有其發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。不同物質都有特定的吸收光譜，根據(jù)溶液的吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質成分。

        鈣燈發(fā)射光譜：鴇燈光源所發(fā)出380?780nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、 藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜，該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

        氫燈（或笊燈）發(fā)射光譜：氫燈（或気燈）能發(fā)出185-400nm波長的光譜，可作為紫外光光度計的光源。

常用的波長范圍包括：

（1）     200?380nm的紫外光區(qū)；

（2）     380~780nm的可見光區(qū)；

（3）     2.5?25卩m （按波數(shù)計為4000/®米?400/厘米）的紅外光區(qū)。

       用于測量200?380nm的紫外光區(qū)物質吸光度的儀器為紫外分光光度計；

       用于測量380?780nm的可見光區(qū)物質吸光度的儀器為可見光分光光度計（或比色計）：

       用于測量2.5?25〃 m （按波數(shù)計為4000/厘米?400/厘米）的紅外光區(qū)物質吸光度的儀器為紅外分光光度計 或原子吸收分光光度計。

工作原理

       光譜儀和分光光度計釆用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源， 光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品 的濃度成正比。

       單色光輻射穿過被測物質溶液吋，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比， 其關系如下式：

A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc

式中：A為吸光度：Io為入射的單色光強度；1為透射的單色光強度：T為物質的透射率；k為摩爾吸收系數(shù); L為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；c為物質的濃度；

儀器用途

1.    核酸的定量

       核酸定量是紫外光譜儀和紫外分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核昔酸，單鏈、 雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。

        除了核酸濃度，光譜儀和分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值， 用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nmo

       純凈的樣品，比值大于1.8 （DNA）或者2.0 （RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類 物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比 值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

2.    蛋白質的直接定量（UV法）

       這種方法是在280nm波長直接測試蛋白，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法, 將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存 在一些雜質，一般要消除320nm的“背景"信息。

3.    比色法蚩白質定量

       蛋白質通常是多種蛋白質的混合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸） 與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反映的氨基酸數(shù)目直接相關，從而 反映蛋白質濃度。比色方法一般有BCA、Bradford、Lowry等兒種方法。

4.    細菌細胞密度（OD 600）

       實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要 釆用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng) 液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。

5.    海洋學研究中痕量物質濃度

       WPI公司設計長光程液態(tài)樣本流通池（LWCC）具有50、100、250和500不同的光程可以選擇。因此，不同 光程長度的LWCC配合適的光源和檢測器，常用于海洋學應用中營養(yǎng)物分析的流體注射分析系統(tǒng)（如硝酸鹽、 亞硝酸鹽、磷酸鹽和鐵離子檢測等）。海水和淡水中CDOM （有色溶解有機物含量）的檢測，因為海水中CDOM的 含量極低（0.007m-l）。

6.    大氣環(huán)境中超低含量物質濃度

      大氣中的SO2、硝酸鹽、亞硝酸鹽、羥基、棕碳、黑碳、水溶性鐵、氣溶膠等含量很低，使用普通的分光光 度計很難檢測出來。將大氣中釆集的樣本液態(tài)化，再配合不同光程的LWCC進行檢測，可以將這些含量極低的 物質加以檢出。